ELENA MARTÍNEZ BALSALOBRE, MANUEL BERNABE GARCIA, ENRIQUE CARRASCO PIÑERA, MONIQUE ANCHELIN, FRANCISCA ALCARAZ PÉREZ, JESÚS GARCÍA CASTILLO, MARIA LUISA CAYUELA FUENTES,

• [GI/IMIB/C003/2011] Cirugía digestiva, endocrina y trasplante de órganos abdominales

El pez cebra es un excelente modelo animal para estudiar la regeneración, puesto que varios de sus órganos tienen la capacidad de regenerarse. En concreto, la aleta caudal es uno de los mejores órganos para este estudio por su fácil acceso, estructura simple y rápida capacidad de regeneración. La telomerasa (tert) tiene un papel importante en regeneración y cáncer, al ser sobreexpresada en tejidos que están regenerando y en el 90% de los tumores. Existe, por tanto, un 10% de tumores que mantienen los telómeros de forma independiente a la telomerasa (ALT, (“alternative lengthening of telomeres”)). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio demuestran que peces deficientes en tert pueden regenerar completamente la aleta caudal tras una o sucesivas amputaciones, por lo que el mecanismo ALT debe estar presente en los peces cebra, constituyendo el primer modelo in vivo para este mecanismo. Dada la importancia del modelo en cáncer y regeneración pretendemos caracterizarlo de forma más profunda.

Medidas de longitud telomérica mediante citometría de flujo. Detección de los círculos de DNA telomérico (CCassay) como se describe en Lau LM et al (2013) para cuantificar las secuencias teloméricas de cada genotipo en diferentes condiciones de regeneración. Mediante extracción de RNA de las aletas amputadas y PCR a tiempo real se estudiaron los posibles genes implicados en la regeneración para los diferentes genotipos. Mediante inyección de morfolinos “in vivo” (oligonucleótidos sintéticos que bloquean el proceso de traducción del RNA, permitiendo bloquear selectivamente determinados genes) se consiguió una inhibición de nbs1 y atr, genes implicados en el mecanismo ALT, para poder estudiar el área regenerada de los distintos genotipos tras la amputación en ausencia de ALT.

El laboratorio dispone de tres líneas de pez cebra, una línea silvestre y dos mutantes en los componentes de la telomerasa, tert y tr. Mediante la amputación repetitiva y seriada de la aleta caudal y la medida de la longitud telomérica de los tejidos amputados se ha demostrado la implicación de ALT en el proceso regenerativo de la aleta caudal en el caso de los peces deficientes en telomerasa. Estos tejidos son capaces de regenerarse manteniendo su longitud telomérica aunque carezcan de telomerasa. El uso de marcadores del mecanismo ALT, como la presencia de círculos de DNA telomérico extra-cromosómicos y la expresión de los genes nbs1 y atr, ha corroborado la existencia de ALT en pez cebra. Aunque ALT permite la regeneración en la aleta caudal en ausencia de telomerasa, hay otros tejidos donde la enzima es imprescindible para la regeneración, como en el corazón. Entonces la existencia de ALT estaría limitada a ciertos tejidos. Quizás las aletas al estar más sometidas a daños en el entorno natural del pez, posean este mecanismo complementario para facilitar la regeneración.

Los peces cebra adultos tert-/- y tr-/- presentan durante la regeneración de la aleta caudal marcadores del mecanismo ALT, como un incremento de círculos extra-cromosómicos de DNA telomérico y mayor expresión de atr y nbs1, que los animales silvestres. La inhibición del mecanismo ALT, a través de atr y nsb1, disminuye la capacidad regenerativa de la aleta caudal de peces cebra adultos deficientes en actividad telomerasa. Este modelo puede ser utilizado para la búsqueda de fármacos que afecten a aquellos tumores que utilizan ALT para el mantenimiento de sus telómeros.