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ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE EGFR EN BLASTOCISTOS BOVINOS
Autores:
LEOPOLDO GONZÁLEZ BRUSI
,
ASCENSIÓN GUILLÉN MARTÍNEZ
,
BLANCA ALGARRA OÑATE
, ALFONSO GUTIÉRREZ ADÁN,
MANUEL AVILES SANCHEZ
,
Grupos de investigación:
[GI/IMIB/C012/2011] Integración morfofuncional de células y tejidos
Comunicación:
Antecedentes:
Introducción Las técnicas de reproducción asistida (TRA) tienen un gran impacto en la salud humana y en las especies de interés ganadero. Tras la fecundación in vitro se consigue el desarrollo embrionario hasta la etapa de blastocisto y posterior transferencia a la madre receptora. Se ha visto que el desarrollo embrionario in vitro no es eficitente obteniéndose un 50% de blastocisto en el mejor de los casos comparado con los resultados obtenidos in vivo en el caso de la especie humana. Por ello, es necesario conocer aquellos mecanismos moleculares implicados en este proceso que nos permitan mejorar la tasa de eficiencia de las TRA. Se ha visto que en el oviducto y en el embrión se expresan ciertos factores de crecimiento y sus receptores. EGFR (epidermal growth factor receptor) es un receptor tirosina quinasa presente en la superficie de la membrana plasmática que reconoce ligandos extracelulares de la familia de EGF, y activa varias cascadas de transducción de señales (MAPK, Akt y JNK) que promueven la proliferación celular. Algunos de los factores producidos por el tracto reproductor femenino y embriones son EGF y TGF-?. En ratón y vaca, la suplementación del medio con estos factores de crecimiento mejora los resultados de FIV. Se ha visto en algunas especies (ratón, humano, cerdo), que el EGFR, que reconoce a ambos factores, se expresa en morula y blastocisto. Sin embargo, hasta la fecha no se ha identificado su expresión en embriones bovinos. Objetivos El objetivo de nuestro estudio es identificar la expresión del EGFR en blastocistos bovinos.
Métodos:
En este experimento, RNA extraído de blastocistos desarrollados in vitro se retrotranscribió a cDNA. Después, mediante el empleo de cebadores específicos del cds de EGFR y del mRNA de ACTB (usado como control) se llevó a cabo una PCR para amplificar ambas secuencias, se empleó el kit KAPA2G Fast HotStart siguiendo las instrucciones del fabricante. Entonces, los productos de electroforesis se dejaron correr durante 40 minutos a 90V en un gel de agarosa al 1.5% con GelRedTM. El gel se fotografió en presencia de luz ultravioleta de 365 nm. El producto de PCR correspondiente a un fragmento de 248pb de EGFR se purificó mediante el DNA Clean & Concentrator KitTM de Zymo Research.
Resultados:
Se observó la presencia de un amplicón con el número de pares de bases esperado tras la PCR en cada uno de los replicados. La secuenciación de este amplicón reveló una total coincidencia con la secuencia del mRNA de EGFR (216-464pb de la secuencia XM_592211.8 depositada en Genbank).
Conclusiones:
Mediante el diseño experimental planteado se ha detectado la presencia de EGFR en blastocisto de vaca. En futuros experimentos se analizará la existencia de la proteína, si presenta algún patrón concreto de localización dentro del blastocisto (masa celular interna vs trofoectodermo) y la posible modulación de su expresión en presencia de diferentes concentraciones de EGF en el medio.
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