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CÉLULAS MESENQUIMALES DE MEMBRANA AMNIÓTICA MURINA: PROPIEDADES PLURIPOTENCIALES Y DE INMUNOMODULACIÓN.
Autores:
ANA ISABEL GARCIA GUILLEN
,
ESTHER MARÍA GARCÍA NAVARRO
,
JOSE MARIA MORALEDA JIMÉNEZ
,
JOAQUÍN GARCÍA-ESTAÑ LÓPEZ
,
DAVID GARCÍA BERNAL
,
NOEMI MARIN ATUCHA
,
Grupos de investigación:
[GI/IMIB/C061/2011] TRASPLANTE HEMATOPOYÉTICO / TERAPIA CELULAR
Comunicación:
Antecedentes:
Dos de las características que hacen de las células madre mesenquimales estromales (MSC) una fuente atractiva en medicina regenerativa son su capacidad de pluripotencialidad y su propiedad inmunomoduladora sobre células del sistema inmune. Las MSC presentan una baja expresión de los antígenos HLA I y expresión negativa para los antígenos HLA II, responsables del rechazo de injertos y trasplantes. En diversos estudios se ha observado que estas células tienen la capacidad de inhibir la proliferación y función de células T, B y NK. En la membrana amniótica humana, un tejido extraembrionario que se desecha tras el parto, se ha demostrado la existencia de MSC capaces de diferenciarse a diferentes líneas de las capas germinales in vitro y con propiedades inmunomoduladoras y baja inmunogenicidad y tumorigenicidad in vivo. Teniendo en cuenta que el ratón es una herramienta clave en investigación y la necesidad de ensayos preclínicos en animales para el futuro de la terapia celular en humanos, el objetivo de este trabajo ha sido el aislamiento, cultivo y caracterización de las MSC de la membrana amniótica murina (MSC-MAm), estudiando como objetivo específico, su potencial de diferenciación y la capacidad inmunomoduladora.
Métodos:
Las MAm se aislaron de ratones hembra C57BL/6 preñadas y el cultivo celular se obtuvo mediante la digestión enzimática del tejido. La caracterización de las células madre mesenquimales se llevó a cabo mediante citometría de flujo. El potencial de diferenciación se estudió mediante condiciones de cultivo específicas. La diferenciación osteogénica se verificó mediante tinción con Alizarin Red, reacción de actividad Fosfatasa Alcalina y expresión de ostepontina mediante inmunofluorescencia. La diferenciación adipogénica se detectó mediante tinción con Oil Red y anticuerpos específicos para FABP4, mientras que la diferenciación condrogénica se estudió con anticuerpos frente a Colágeno II y tinción de mucopolisacáridos con azul de Alcián. Por otro lado, la capacidad inmunomoduladora de las células mesenquimales de membrana amniótica (MSC-MAm) cultivadas in vitro, se estudió mediante la técnica de cultivos mixtos de linfocitos (MLC) en un contexto alogénico, utilizando como células estimuladoras esplenocitos de ratón Balb/c y como respondedoras esplenocitos de ratón C57BL/6 cultivados en presencia de diferentes ratios de MSC-MAm. Finalmente, mediante técnica de ELISA, se detectó la concentración de diversas citoquinas pro y anti-inflamatorias en los sobrenadantes de los diferentes cultivos mixtos.
Resultados:
Mediante la caracterización por citometría de flujo obtuvimos una expresión positiva para los marcadores de célula madre mesenquimal CD44, CD90, CD105 y CD73 y una expresión negativa del marcador de células hematopoyéticas CD45 y baja expresión de CD34. En ensayos de diferenciación in vitro se demostró la plasticidad de las MSC-MAm por su capacidad de diferenciación a osteoblastos, adipocitos y condrocitos. El ensayo de MLC mostró que las MSC-MAm en diversos pases de cultivo inducen una inhibición dosis-dependiente de la proliferación de los esplenocitos C57BL/6, obteniendo una inhibición más homogénea e importante en el caso de las MSC-MAm sembradas en un pase 4. En los sobrenadantes obtenidos en el experimento se observó un aumento en la concentración de citoquinas antiinflamatorias IL10 y TGF?, y una disminución en la concentración de las citoquinas pro-inflamatorias IFN? y TNF?, en ambos casos dosis dependiente.
Conclusiones:
Las células mesenquimales obtenidas a partir de MAm demuestran ser células capaces de diferenciarse in vitro y con propiedad inmunomoduladora. Estas características las convierte en una fuente interesante para diferentes estudios preclínicos en ratones en diversas enfermedades de origen inflamatorio y degenerativo.
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