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DOCK10, UN FACTOR DE INTERCAMBIO DE GTP PARA CDC42 Y RAC1 QUE PROMUEVE LA PÉRDIDA DE LA FORMA CELULAR POLIGONAL
Autores:
NATALIA RUIZ LAFUENTE,
MARÍA JOSÉ ALCARAZ GARCÍA
,
AZAHARA MARÍA GARCÍA SERNA
,
SILVIA SEBASTIÁN RUIZ
,
MARÍA ROSA MOYA QUILES
,
ANA MARÍA GARCÍA ALONSO
,
ANTONIO PARRADO GONZÁLEZ
,
Grupos de investigación:
[GI/IMIB/C006/2011] INMUNOLOGÍA E INMUNOTOLERANCIA EN TRASPLANTES Y ENFERMEDADES DE BASE INMUNOLÓGICA
[GI/IMIB/C005/2011] Investigación en Epidemiología y Salud Pública
Comunicación:
Antecedentes:
DOCK10 es uno de los 11 miembros de la familia de proteínas DOCK, que actúan como factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) bien para Cdc42, Rac1, o ambas GTPasas Rho. Sus homólogos DOCK9 y DOCK11 son GEFs para Cdc42. DOCK10 se ha encontrado sobreexpresado en casos agresivos de carcinomas tiroideos papilares y de cáncer de mama. Su actividad también se ha asociado a la transición epitelio-mesénquima en carcinomas de células escamosas y, en un modelo de metástasis en cáncer de mama, a las células trailblazer que guían la invasión colectiva. Mediante interferencia por RNA (RNAi), se ha relacionado a DOCK10 con una inhibición de la morfología elongada y del movimiento mesenquimal, a favor de una morfología redondeada y un movimiento ameboide, propio de las células metastásicas. El objetivo de este trabajo ha sido definir la especificidad de DOCK10 por las GTPasas Rho y analizar sus efectos en la morfología celular, citoesqueleto de actina y protrusiones celulares.
Métodos:
Se realizaron ensayos bioquímicos de GST pulldown con 10 GTPasas Rho obtenidas mediante tecnología de ADN recombinante para determinar su interacción con las dos isoformas de DOCK10 de primer exón alternativo, DOCK10.1 y DOCK10.2, así como con DOCK9 y DOCK11, producidas mediante transfección transitoria en la línea celular epitelial 293T. Para el resto de estudios, se generó un modelo de clones estables con expresión inducible de DOCK10 y/o mutantes constitutivamente activos de Cdc42-EGFP o Rac1-EGFP en la línea celular epitelial tumoral HeLa. La actividad como GEF sobre Cdc42 y Rac1 se realizó mediante ensayo pulldown sobre GST-PAK1-PBD. La morfología celular se estudió mediante microscopía óptica y de fluorescencia, en células fijadas para teñir los filamentos de actina con faloidina-rodamina y anti-tag HA-FITC para detectar DOCK10, y tanto en células fijadas como in vivo la fluorescencia de la proteína EGFP fusionada a las GTPasas Rho de expresión inducible.
Resultados:
Las isoformas de DOCK10 interaccionaron con las GTPasas Rac1, Cdc42 y Rac3; mientras que sus homólogos DOCK9 y DOCK11 mostraron la especificidad ya conocida por Cdc42. Además, DOCK10, sin modificar sus niveles de expresión, aumentó los niveles de Rac1 y Cdc42 activos, concomitante a cambios en la morfología celular y organización del citoesqueleto. En los clones expresores de DOCK10 se observó una pérdida de la elongación celular, mayor superficie de extensión, aparición de ondulaciones de membrana y filopodios. Los clones expresores de los mutantes constitutivamente activos de Rac1 y Cdc42 también mostraron pérdida de la morfología elongada, sin embargo mientras que Rac1produjo un aumento del área y formación de ondulaciones de membrana, Cdc42 condujo a una disminución del área y formación de filopodios. Además, la co-expresión de DOCK10 con cada uno de los mutantes potenció sus respectivos fenotipos.
Conclusiones:
DOCK10 es un GEF específico de las GTPasas Rho Cdc42 y Rac1. A nivel celular, DOCK10 participa en la organización del citoesqueleto de actina, aumentando la extensión de la superficie celular de adhesión y fomentando la pérdida de elongación. Además, DOCK10 actúa, a través de Rac1, induciendo la formación de ondulaciones de membrana y, a través de Cdc42, fomentando la aparición de filopodios. Estas funciones moleculares y celulares de DOCK10 podrían participar en los mecanismos que controlan el movimiento celular que conduce a la migración y metástasis.
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