VERÓNICA PALMA BARQUEROS, JOSE VICENTE SÁNCHEZ, EVA CAPARRÓS PÉREZ, RAÚL TERUEL MONTOYA, JUAN LUIS DELGADO MARIN, JOSÉ ELISEO BLANCO CARNERO, Mª LUISA LOZANO ALMELA, ANA ISABEL ANTÓN, VICENTE VICENTE GARCÍA, FRANCISCA FERRER MARÍN, JOSÉ RIVERA POZO,

• [GI/IMIB/C001/2011] HEMATOLOGÍA Y ONCOLOGÍA MÉDICA CLÍNICO-EXPERIMENTAL
• [GI/IMIB/C020/2011] Investigación en Pediatría

Los inmunoreceptores plaquetarios con dominios tirosina activadores (ITAM: glicoproteína VI [GPVI], FcyRIIA, y CLEC-2) o inhibidores (ITIM: PECAM-1 o G6b-B), son relevantes en la función de las plaquetas en procesos fisiológicos y patológicos como la hemostasia, integridad vascular, inflamación, o separación de vasos linfáticos y sanguíneos. Las plaquetas neonatales (PN) son, respecto a las de adulto (PA), intrínsecamente hiporreactivas frente a la mayoría de agonistas, por mecanismos desconocidos. El papel de los receptores ITAM e ITIM en esta hiporreactividad no ha sido explorado.

En muestras de sangre periférica de adultos y de cordón umbilical (n?6), analizamos: 1) Expresión cuantitativa de las GPs Ib-alfa, IIIa, Ia y VI, CLEC-2, PECAM-1 y G6b-B por citometría de flujo (CF) (Platelet Gp Screen, Biocytex); 2) Niveles de GPVI, CLEC-2 y PECAM-1 en lisados plaquetarios por inmunoblotting; 3) Función de receptores acoplados a proteínas G o GPCR y de receptores ITAM (GPVI, FcyRIIA y CLEC-2). Para ello medimos, por CF en sangre total diluida, la secreción de selectina-P (CD62) y la unión de fibrinógeno a GPIIb/IIIa, basalmente y tras estimulación con PAR-1 25µM, PAR-4 250µM, ADP 25µM, CRP 5µg/mL, CD9 5µg/mL y rodocetina 100nM; 4) Señalización vía GPVI y CLEC-2, valorando la fosforilación de fosfolipasa C gamma 2 (PLCy2) y tirosin cinasa de bazo (Syk), respecto a los niveles totales de PLCy2 y Syk, por immunobloting fosfoespecífico (anti-PLCy2 P-Tyr1217, anti-Syk P-Tyr525/526), en lisados de plaquetas activadas a distintos tiempos y distintas dosis con CRP o rodocetina, agonistas de GPVI y CLEC-2, respectivamente.

Las PN, vs. PA, mostraron niveles (moléculas/plaqueta) significativamente reducidos de GP Ia (6260±1262 vs. 7861±1777, p=0.003), pero no de las GPs IIIa y Ib-alfa. Mientras la expresión de CLEC-2 y G6b-B no fue significativamente distinta en PN y PA, si lo fue la de GPVI (5421±1148 vs. 6966±929, p=0.004) y la de PECAM-1 (8915±1394 vs. 11496±1657, p=0.001). Los ensayos de immunoblotting mostraron una menor expresión de GPVI, CLEC-2 y PECAM-1 en PN (55, 57 y 48% vs. PA, respectivamente, p<0.05). Para todos los agonistas ensayados, la unión de fibrinógeno fue significativamente menor en PN que en PA (Mediana de fluorescencia (MFI): 7 a 42% vs. PA, p<0.05). También estaba reducida la secreción de selectina-P en PN estimuladas con PAR1 (MFI: 85±13.8 vs. 145.2±49.8, p=0.01), CRP (MFI: 55.8±30.2 vs. 150.3 ± 60, p=0.03) y rodocetina (MFI: 10.3±8.8 vs. 48.7± 5.2, p=0.01). En consonancia, estudios de señalización mostraron una menor expresión de las proteínas PLCy2 and Syk en PN (5.01±1.4 vs. 8.2±1.76 UA (unidades arbitrarias) y 2.9±1.9 vs. 4.1±2.4 UA, respectivamente), alcanzando diferencias significativas sólo para Syk (p=0.03). Estudios dosis-respuesta y time-course con CRP y rodocetina revelaron una ligera reducción en el nivel de fosforilación de PLCy2 (P-Tyr1217) y Syk (P-Tyr525/526) en PN en comparación con PA.

Nuestro estudio revela diferencias significativas en la expresión de receptores plaquetarios durante el desarrollo. La expresión, funcionalidad y/o señalización de los receptores ITAM (GPVI, FcyRIIA, CLEC-2) es distinta en PN respecto a PA, y esto puede contribuir a la hiporeactividad plaquetaria neonatal. La disminución simultánea de GPVI y PECAM-1 podría ser un mecanismo compensatorio para evitar una excesiva hiporectividad de las plaquetas neonatales. ISCIII (PI14/01956) y CIBERER (CB15/00055)