ALBERTO BAROJA MAZO, VINCENT COMPAN, Mª ROSARIO FÁTIMA MARTÍN SÁNCHEZ, CARLOS DE TORRE MINGUELA, PABLO PELEGRIN VIVANCOS,

• [GI/IMIB/C003/2011] Cirugía digestiva, endocrina y trasplante de órganos abdominales

Caspasa-1 es una proteasa que controla la liberación de diferentes proteínas carentes de péptido líder, incluyendo su propia secreción. El secretoma de caspasa-1 comprende las citoquinas pro-inflamatorias IL-1b e IL-18, además de la alarmina HMGB1. Sin embargo, poco se sabe acerca de la vía de liberación no convencional de caspasa-1. La secreción de IL-1b incluye la liberación de microvesículas y/o exosomas. Los exosomas son secretados al espacio extracelular por la fusión de endosomas multivesiculares a la membrana plasmática. Aunque se ha sugerido que ciertos compartimientos endosomales pueden desempañar algún papel en la secreción no convencional de proteínas, IL-1b no colocaliza con marcadores de endosomas, tales como EEA1, y el pro-procesamiento de IL 1b por la caspasa-1 en los macrófagos es más un evento citosólico que precede a su liberación.

Se utilizó una línea celular de monocitos/macrófagos humanos (THP1) y macrófagos derivados de médula ósea murinos (BMDMs). Co-immunoprecipitación y Western-blotting.- Para la co-IP, el sobrenadante se incubó con 1,5 µg de anti-EEA1 y después con proteína G-agarosa. Las transferencias se revelaron con anticuerpos específicos contra EEA1, caspasa-1 y IL-1? entre otros. Inmunocitoquímica y microscopía.- Se adquirieron imágenes con un microscopio Delta Vison RT usando una cámara Coolsnap HQ. Estas imágenes fueron deconvolucionadas por medio del software Sotworx. Igualmente se llevó a cabo un análisis de colocalización usando el plugin Coloc 2 para ImagJ (NHI). Silenciamiento génico de EEA1.- Células de médula ósea de ratón fueron infectadas con partículas lentivirales portando un shRNA específico para EEA1, y los experimentos se llevaron a cabo después de 7 días de diferenciación de los macrófagos en cultivo.

Hemos encontrado que siguiendo la activación del inflamasoma NLRP3 en macrófagos, la caspasa-1 madura trafica cerca de los endosomas donde la propia caspasa cortaría la proteína endosomal EEA1. La activación del inflamasoma NLRP3 por diferentes vías resultó en el procesamiento y liberación de EEA1. La inhibición farmacológica o genética de la activación de caspasa-1 abolió este procesamiento y liberación de EEA1. Por otro lado, el silenciamiento génico de EEA1 en los macrófagos, resultó en un descenso de la liberación de caspasa-1 e IL-1b después de la activación del inflamasoma, pero no afectó a la liberación de partículas de NLRP3 y ASC.

Nuestros datos demuestran que la activación del inflamasoma NLRP3 a través de diferentes estímulos precede la liberación y el procesamiento de EEA1 y que ambos procesos son dependientes de la activación de caspasa-1. Además, nuestros resultados apuntan a que el corte de EEA1 podría impedir la fusión endosomal y permitir así a los endosomas de reciclado fusionarse con la membrana plasmática. El uso de endomembranas para reparar la membrana plasmática es un mecanismo de protección para mantener la viabilidad celular en las células de mamíferos. Durante la activación del inflamasoma la integridad de la membrana plasmática queda comprometida y se ha sugerido que la exocitosis de lisosomas durante la piroptosis es un intento de la célula por reparar los poros formados en la membrana. Este mecanismo de protección podría ser usado como ruta de liberación no convencional de citoquinas dependiente de la activación de caspasa-1.