Mª ROSARIO FÁTIMA MARTÍN SÁNCHEZ, ANA ISABEL GOMEZ SANCHEZ, ALBERTO BAROJA MAZO, PABLO PELEGRIN VIVANCOS,

• [GI/IMIB/C003/2011] Cirugía digestiva, endocrina y trasplante de órganos abdominales

La inflamación es una respuesta inmunitaria innata desarrollada frente a infecciones o daño tisular. La inflamación es desencadenada por la liberación de citoquinas pro-inflamatorias tras la activación de receptores de reconocimiento de patrones moleculares innatos del tipo Toll (TLR) o Nod (NLR). Entre ellos la activación del receptor NLR con dominio Pyrina 3 (NLRP3) induce la formación de inflammasomas al asociarse a la proteína ASC. La activación del inflamasoma NLRP3 se induce entre otros estímulos tras el reconocimiento de elevadas concentraciones de ATP extracelular por los receptores purinérgicos P2X7. El inflamasoma NLRP3 induce la activación de caspasa-1 y el procesamiento y liberación de la potente citoquina pro-inflamatoria IL-1b. La IL-1b es una proteína que no sigue la ruta convencional de secreción ya que carece de péptido líder y su mecanismo de liberación no se conoce con exactitud. En este estudio describimos el efecto de punicalagina como el primer compuesto capaz de inhibir la liberación de IL-1b, pero no su maduración por parte del inflamasoma NLRP3. Este compuesto nos ha permitido estudiar la ruta de liberación de IL-1b.

En Macrófagos estimulados con LPS y ATP extracelular (5 mM) en presencia o ausencia de punicalagina (25 ?M), se determinó el procesamiento y secreción de IL-1b mediante ELISA y Western blot. A continuación investigamos el efecto de punicalagina sobre la activación del inflamasoma NLRP3 inducida por ATP, para lo cual realizamos medidas de iones (Ca+2 y K+) intracelulares, ensayos de transferencia de energía de resonancia por bioluminiscencia (BRET), inmunofluorescencia y medidas enzimáticas de actividad caspasa-1. Por último, mediantes ensayos de captación del fluoróforo Yo-Pro-1 y la monitorización microscópica de la fluidez de la membrana plasmática a tiempo real, estudiamos el efecto de punicalagina sobre la permeabilización de membrana inducida tras la estimulación de P2X7.

El tratamiento con punicalagina fue capaz de inhibir selectivamente la liberación de IL-1b madura inducida por la activación del receptor P2X7, pero sorprendentemente no tuvo ningún efecto sobre el procesamiento de esta citoquina. Además, la punicalagina no afectó a la activación del inflamasoma NLRP3, la oligomerización de ASC, la activación de caspasa-1 o la liberación de otras citoquinas que siguen la ruta convencional de liberación, como la IL-6 o el TNF-?. Además, la punicalagina no afectó directamente a la activación de P2X7, permitiendo el flujo de Ca+2 y K+ característico de la apertura de estos canales catiónicos, pero interesantemente bloqueó la permeabilización de membrana plasmática al fluoróforo Yo-Pro-1. Por último, la punicalagina fue capaz de inhibir la piroptosis, un tipo específico de muerte celular inducida por caspasa-1. El mecanismo de acción de la punicalagina fue a nivel de la membrana plasmática, donde fue capaz de estabilizar la fluidez de los lípidos de la membrana e inhibir la formación de evaginaciones.

Estos datos identifican al polifenol punicalagina como una posible molécula anti-inflamatoria capaz de inhibir específicamente la secreción de la citoquina IL-1b inducida por la activación del receptor P2X7.