ANA TAPIA ABELLÁN, DIEGO ANGOSTO BAZARRA, ALBERTO BAROJA MAZO, MARIA CARMEN BAÑOS GREGORI, PABLO PELEGRIN VIVANCOS,

• [GI/IMIB/C003/2011] Cirugía digestiva, endocrina y trasplante de órganos abdominales

NLRP3 es una proteína perteneciente a la familia de receptores intracelulares del sistema inmunitario innato de tipo Nod (NLR) activada en respuesta a infecciones y/o señales de peligro endógenas (ATP extracelular o cristales patogénicos). Tras su activación, NLRP3 oligomeriza formando plataformas multiproteicas denominadas inflamasomas, donde se produce la activación de la enzima caspasa-1, que provoca el procesamiento y liberación de la citoquina pro-inflamatoria IL-1?, implicada en el proceso inflamatorio. La activación anómala de NLRP3 está relacionada con varias enfermedades, entre las que se encuentran los síndromes periódicos asociados a criopirina, Alzheimer, diabetes tipo 2, o la esclerosis múltiple, entre otras. MCC950 es un inhibidor específico de NLRP3, capaz de bloquear la liberación de IL-1? y la muerte celular asociada a la activación de este inflamasoma tanto en ensayos in vitro como en modelos preclínicos, donde es capaz entre otros, de atenuar los síntomas asociados a la esclerosis múltiple. Sin embargo, su mecanismo de acción sobre NLRP3 se desconoce hasta el momento, siendo su estudio un punto clave para su uso en la clínica.

La producción de IL-1? y la determinación de muerte celular se analizó en macrófagos derivados de médula ósea de ratones frente distintos estímulos activadores de NLRP3 como son nigericina (ionóforo que provoca la pérdida del potasio intracelular) y ATP, en presencia o ausencia de MCC950. En otra serie de experimentos, NLRP3 fue fusionado en su extremo N-terminal a la proteína fluorescente amarilla (YFP) y en su extremo C-terminal a la luciferasa (Luc). Esta proteína fue expresada en células HEK293 para la realización de ensayos funcionales mediante transferencia de energía de resonancia por bioluminiscencia (BRET), que nos permite realizar estudios conformacionales en las proteínas tras someter a las células a distintos estímulos. Por último, mediante microscopia de fluorescencia estudiamos la agregación de NLRP3 inducida por nigericina en ausencia o presencia de MCC950. Además el efecto del inhibidor se probó sobre la oligomerización de un NLRP3 mutante (D303N) que está constitutivamente activo.

El inhibidor MCC950 a 10 µM bloqueó la liberación de IL-1? así como la muerte celular en macrófagos tras la estimulación con nigericina o ATP. En ensayos BRET, la presencia de MCC950 a 10 µM redujo la respuesta de NLRP3 asociada a nigericina y ATP, indicando la posible interacción entre inhibidor y NLRP3. Por microscopia de fluorescencia observamos que el tratamiento durante 30 minutos con MCC950 a 10 µM bloqueó la agregación de NLRP3 tras activación con nigericina. Así mismo, MCC950 fue capaz de disolver los agregados preformados de NLRP3 mutante tras 24 horas de tratamiento.

Estos resultados sugieren que MCC950 es capaz de inhibir directamente la proteína NLRP3, impidiendo la formación de oligómeros de NLRP3 tras su activación como disolviendo los agregados preformados de esta proteína. Para determinar en qué dominio de NLRP3 actúa el inhibidor se están realizando quimeras proteicas intercambiando dominios de NLRP3 con otros NLR estructuralmente similares sobre los que el inhibidor MCC950 no actúa.