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NUEVAS VARIANTES MOLECULARES DE RASGRP2, QUE CODIFICA A CALDAG-GEF1, ASOCIADAS A DISFUNCIÓN PLAQUETARIA Y LEUCOCITARIA.
Autores:
JOSÉ RIVERA POZO
,
Grupos de investigación:
[GI/IMIB/C001/2011] HEMATOLOGÍA Y ONCOLOGÍA MÉDICA CLÍNICO-EXPERIMENTAL
Comunicación:
Antecedentes:
Defectos congénitos en proteínas clave en la activación de ?IIb?3 pueden causar disfunción plaquetaria. CalDAG-GEFI, un intercambiador de nucleótidos de guanina codificado por RASGRP2, se expresa en plaquetas y neutrófilos y es esencial en la activación de Rap1 y la subsiguiente activación de integrinas. Hasta la fecha, sólo se han descrito tres hermanos con disfunción plaquetaria causada por una variante RASGRP2. Los objetivos de este estudio han sido caracterizar funcional y molecularmente 5 pacientes de 4 familias no relacionadas con diátesis hemorrágica y alteración de la agregación plaquetaria
Métodos:
Los probandos eran 2 hermanos españoles (55 y 46a), un niño de chino (9a) y dos niños portugueses no relacionados (4 y 7a), todos ellos con historial hemorrágico (BS?7, BAT-ISTH) y sospecha de trastorno plaquetario hereditario. Evaluamos recuentos y morfología de células sanguíneas, funcionalidad plaquetar y de neutrófilos (PFA-100, glicoproteínas [GPs], secreción granular, unión de fibrinógeno [fg] por citometría de flujo, agregación, retracción de coágulo, adhesión y extensión sobre fg). El DNA de los pacientes se amalizó por exoma completo (ExC) (casos españoles) o un panel NGS de 71 genes (los 3 niños). Las mutaciones halladas se confirmaron por Sanger. La expresión plaquetar de CalDAG-GEFI se cuantificó por Western-blot. Purificamos una variante de CalDAG-GEFI y la forma nativa y comparamos su capacidad de activar Rap1 en un ensayo in vitro con Bodipy FL GDP
Resultados:
Los 5 pacientes mostraron recuentos y morfología plaquetaria y de neutrófilos normales, así como un patrón de función plaquetaria semejante: expresión normal de GPs (Ib/IX,alphaIIbbeta3,alfaIIbeta1, GPVI); PFA-100 alargados (Col-Epi>300s); agregación severamente disminuida en respuesta a ADP y dosis baja colágeno, pero normal o poco reducida con otros agonistas a dosis altas (PAR1, PAR4, CRP, Ac. Araquidónico, PMA); una escasa afectación de la secreción de selectina-P y 14C-serotonina, y de la retracción de coágulo y adhesión/extensión plaquetar. Identificamos en los pacientes nuevas mutaciones homocigotas en RASGRP2: c.337C>T (p.R113X)(hermanos españoles); c.1142C>T (p.S381F)(niño chino) y c.706C>T (p.Q236X) o c.887G>A p.C296Y en cada uno de los niños portugueses. La expresión de CalDAG-GEFI, pero no la Rap1 ni la de su regulador Rasa3, fue casi indetectable. La variante de CalDAG-GEFI p.S381F purificada, a diferencia de la nativa, mostró nula capacidad para activar Rap1 in vitro. En concordancia, las plaquetas de los enfermos mostraron una reducida unión de fg a alfaIIbbeta3, tras activación con todos los agonistas (ADP, PAR1, PAR4, CRP, convulxina) salvo con PMA (activador directo de alfaIIbbeta3). Los neutrófilos de los pacientes mostraron secreción (CD11b) normal, pero una reducción relevante en la unión de fg a la beta2 en células activadas con fMLP o Mn2+. El modelado de las variantes p.381F y p.296Y (Pymol) mostró una importante repercusión conformacional en la estructura de CalDAG-GEFI nativa.
Conclusiones:
Presentamos la mayor serie descrita hasta el momento de anomalías congénitas funcionales de plaquetas y neutrófilos debidas a 4 nuevas mutaciones en RASGRP2. La caracterización de estas variantes refleja el impacto sobre la expresión/función de CalDAG-GEFI y por ende sobre la capacidad de las integrinas de estas células para activarse y unir sus ligandos. Financiación: ISCIII y Feder, PI14/01956 & CB15/00055. Estudio englobado en el proyecto “Caracterización funcional y molecular de trastornos plaquetarios congénitos” de la SETH
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