CARLOS DE TORRE MINGUELA, MARÍA BARBERÁ CREMADES, ANA ISABEL GOMEZ SANCHEZ, ALBERTO BAROJA MAZO, Mª ROSARIO FÁTIMA MARTÍN SÁNCHEZ, PABLO PELEGRIN VIVANCOS,

• [GI/IMIB/C003/2011] Cirugía digestiva, endocrina y trasplante de órganos abdominales

Los macrófagos son componentes esenciales de la respuesta inmune innata involucrados tanto en el proceso inflamatorio agudo como en el crónico. Además, los macrófagos no son sólo la clave del inicio de la respuesta inflamatoria sino que también contribuyen a la iniciación del proceso de resolución de la inflamación. Esta habilidad para cambiar desde un fenotipo pro-inflamatorio (M1) a uno anti-inflamatorio (M2) depende del ambiente de citoquinas en el que se encuentre. La activación mediante ATP extracelular, una señal de peligro liberada en las zonas de inflamación y daño tisular, del receptor purinérgico P2X7 (P2X7R) en macrófagos M1 ha sido ampliamente estudiada como el interruptor fisiológico del inflamasoma NLRP3, responsable a su vez de la liberación de distintas citoquinas inflamatorias (IL-1b y IL18). En condiciones inflamatorias, P2X7R también controla la liberación de otras proteínas (proteasas lisosomales) o componentes del inflamasoma (ASC, NALP3, caspase-1) sugiriendo que la activación de P2X7R induce la liberación de un secretoma poco caracterizado. Además, previamente describimos como los cambios en el estado de polarización del macrófago interrumpen la señalización entre el receptor y el inflamasoma-NLRP3, sugiriendo una función potencial de P2X7R en la fase de resolución de la inflamación. Los cambios significativos observados en la acción del ATP sobre la producción de IL-1? en los distintos estados de polarización del macrófago nos plantea si pueden estar relacionados con cambios en la composición del secretoma asociado a P2X7R independientemente de la activación de inflamasoma-NLRP3.

Los cambios en la composición del secretoma de P2X7R fueron analizados mediante espectrometría de masas (LC-MS/MS) y “arrays” de anticuerpos a partir de sobrenadantes de macrófagos estimulados con ATP. Estos macrófagos se obtuvieron derivados de médula ósea de ratones silvestres (WT) o “knock-out” para P2rx7. La polarizaron a M1 o M2 se consiguió mediante la incubación previa con LPS o IL-4. La validación del secretoma se realizó mediante las técnicas de ELISA y western blot utilizando tanto una aproximación farmacológica que incluye inhibidores de P2X7R como ratones deficientes en los genes Nlrp3 o Casp1/11.

En este estudio identificamos por primera vez la liberación de 25 proteínas asociadas con la activación de P2X7R y se seleccionaron 9 de ellas por su relevancia en el proceso inflamatorio: el receptor de manosa, CD14, catepsina B, cistatina B, tiorredoxina, anexina A1, isomerasa cis-trans peptidil-prolil A, TNF-a y CCL-2. Para su validación, comparamos su secreción con la liberación de IL-1b y la subunidad p10 de la caspasa-1 activa. Además, hemos caracterizado las diferentes rutas de señalización molecular que conducen a la liberación de las proteínas, que se activan en distintos intervalos de tiempo y que afectan tanto a vías de liberación no convencionales como convencionales.

La activación de P2X7R fue responsable de la liberación de un mayor número de proteínas que las secretadas bajo el control de la activación del inflamasoma-NLRP3. Además, determinamos que la activación de P2X7R induce la liberación de proteínas anti-inflamatorias en macrófagos polarizados a M2, que podrían contribuir a la resolución de la inflamación. Por tanto, la caracterización del secretoma de P2X7R en macrófagos contribuye al desarrollo de nuevos conceptos en la biología general del los macrófagos, donde la liberación de proteínas anti-inflamatorias en macrófagos M2 sugiere por primera vez el potencial papel de P2X7R durante la resolución de la inflamación.